ChIP-seq原理

一文读懂 ChIP-seq：从实验原理到结果图分析

1. 什么是 ChIP-seq，它能做什么？

首先，我们来拆解一下这个名字：

• ChIP = Chromatin Immunoprecipitation (染色质免疫共沉淀)
• seq = sequencing (二代测序)

合在一起，ChIP-seq 的核心思想就是：用一个“钩子”钓出与特定蛋白质结合的 DNA 片段，然后通过测序技术，告诉我们这些 DNA 片段在基因组的什么位置。

简单来说，ChIP-seq 就是用来回答“在细胞内，某个蛋白质（比如转录因子、组蛋白）都结合在哪些 DNA 区域？”这个问题的。

目前，ChIP-seq 主要有两大应用方向：

方向一：研究转录因子 (Transcription Factor, TF)

转录因子就像是基因的“开关”。它们是一些能结合到特定基因上游区域的蛋白质，通过这种结合来开启或关闭基因的表达。

所以，做转录因子的 ChIP-seq，目的就是找到这个“开关”蛋白究竟控制了基因组上的哪些基因。

方向二：研究组蛋白修饰 (Histone Modification)

在我们的细胞核里，长长的 DNA 是缠绕在组蛋白上的。组蛋白可以被加上各种化学“标签”（如甲基化、乙酰化），这些“标签”会影响 DNA 的包裹松紧度，从而调控基因的表达。这就像给基因表达上了一个“音量调节器”。

• 组蛋白乙酰化 (ac)：通常让染色质变“松”，基因更容易表达，相当于“调高音量”。
• 组蛋白甲基化 (me)：情况比较复杂，有的类型是激活转录（如H3K4me3），有的则是抑制转录（如H3K27me3、H3K9me3），相当于“调高或调低音量”。

这里的 H3K4me3 表示在第3号组蛋白（H3）的第4个赖氨酸（K）上有3个甲基化（me3）修饰。

所以，做组蛋白修饰的 ChIP-seq，目的就是查看基因组上哪些区域的“音量”被调高了，哪些被调低了，从而了解基因的表达调控状态。

2. ChIP-seq 的实验流程是怎样的？

整个实验过程可以简化为“固定-打碎-沉淀-纯化-测序”五步曲。

1. **交联固定 (Crosslinking)**：用甲醛处理细胞，把蛋白质和它正结合着的 DNA “粘”在一起，防止它们在后续操作中分开。
2. **打碎 DNA (Fragmentation)**：用超声波或酶将长长的染色质打断成小片段。
3. **免疫沉淀 (Immunoprecipitation)**：加入针对我们目标蛋白的特异性抗体（就像一个精确制导的钩子），这个抗体就会抓住目标蛋白以及与之相连的 DNA 片段。
4. **纯化 DNA (Purification)**：洗掉其他杂质，并将蛋白质消化掉，只留下被目标蛋白“抓住”的那些 DNA 小片段。
5. **建库测序 (Sequencing)**：将这些 DNA 片段进行二代测序，读取它们的序列信息。

3. 如何看懂 ChIP-seq 的结果图？

测序完成后，分析才是重头戏。我们通常会经历质控、序列比对、Peak calling 和功能注释这几个步骤。其中，我们在文章里最常看到的结果图，主要来自后两个步骤。

核心概念：Peak (峰)

我们将测序得到的无数 DNA 短片段比对回参考基因组上。如果某个蛋白在特定位置与 DNA 结合，那么就会有很多来自该位置的 DNA 片段被测序。当把这些片段“堆”在基因组坐标轴上时，就会形成一个像山峰一样的凸起，我们称之为 Peak。

Peak 越高，意味着蛋白和该区域结合的信号越强。

Peak 的形状有讲究：

• 转录因子 的结合位点非常精确，其 Peak 形状通常是又高又窄的“尖峰”。
• 组蛋白修饰 往往覆盖一片区域，其 Peak 形状则是起伏平缓的“宽峰”。

常见结果图解读

1. Peak 在基因组上的分布（Genomic Annotation）

这张图告诉我们，目标蛋白主要喜欢结合在基因组的哪些功能区域。比如，它是不是更倾向于结合在启动子区（Promoter，基因的“开关”区域）、内含子（Intron）还是外显子（Exon）？

2. Peak 在转录起始位点（TSS）附近的富集图

由于基因调控的关键区域通常在转录起始位点（TSS）附近，所以研究者们特别关心蛋白在 TSS 周边的结合情况。这类图通常由两部分组成：

• 峰图（左）：展示了所有基因 TSS 位点上下游区域信号的平均强度，可以看出蛋白结合的总体趋势。
• 热图（右）：展示了每个基因 TSS 位点周围的信号强度，颜色越深代表信号越强。

3. 基因功能富集分析（GO / KEGG）

通过分析 Peak 附近的基因（即蛋白可能调控的目标基因），我们可以了解这些基因主要参与哪些生物学过程（GO分析）或信号通路（KEGG分析）。这能帮助我们从宏观层面理解该蛋白的功能。

4. 基序分析 (Motif Analysis) 的 Logo 图

对于转录因子，它识别并结合的 DNA 序列通常有特定规律，这个规律序列就叫 Motif。通过分析所有 Peak 区域的 DNA 序列，可以找出这个共同的 Motif。
Logo 图就是 Motif 的可视化展示：

• x 轴代表序列位置。
• 每个位置上堆叠的字母代表可能的碱基（A/T/C/G）。
• 字母越大，说明转录因子在这个位置上越倾向于结合该碱基。

通过与已知数据库（如 JASPAR）比对，我们甚至可以推断出这个结合蛋白究竟是哪个转录因子。

5. 多个 ChIP-seq 结果的关联分析

文章中还可能出现韦恩图（Venn Diagram）等，用来比较不同蛋白（或同一蛋白在不同条件下）结合的靶基因有哪些重叠，从而探索它们之间是否存在协同或拮抗的关系。

参考文献

• 一文讲明白ChIP-seq（上）：高分文章里为什么做ChIP-seq?

• 一文讲明白ChIP-seq（下）：这些文献里ChIP-seq结果图是啥意思？